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游离核酸抽提方法选择指引 远慕新闻√

提供者:上海远慕生物科技有限公司   发布时间:2019/8/22  阅读次数:156次   进入该公司展台

人体细胞在凋亡的过程中,DNA断裂并分泌至细胞外。健康细胞,胎儿细胞,肿瘤细胞以及移植的细胞都可以通过这种方式释放游离DNA至血液中。同时cfDNA(cell-free DNA) 是肿瘤和产前诊断研究中,被证实有用的标记物。

随着液体活检技术的不断发展,对这些的游离核酸检测有望成为替代组织活检的重要方法。大家比较熟悉的游离核酸检测手段有定量PCR、NGS等传统方法和正在迅猛发展的数字PCR。

但cfDNA在体液中的含量非常低,通常血清中含量低于10ng/mL。 如何从含量如此低的样本中,抽提出适合检测手段的游离核酸?

液体活检技术的兴起,使得游离核酸样本的数量大增,高通量形式的核酸抽提成为了工作者们的追求,如何低成本解决通量问题?

那就从下方的描述中找到适合您的游离核酸抽提方式吧。

市面上的游离核酸抽提试剂盒大多是基于柱膜法的原理、还有一部分是基于磁珠法的抽提原理。有单管离心、多管真空抽滤、96孔板真空抽滤、磁珠法高通量等形式。最常用的为多管真空抽滤的方式。

多管真空抽滤

采用真空抽滤的方法,在真空抽滤装置上,可同时提取24个1-10mL血清、血浆、尿液等样本, 结合&洗涤过程无需使用离心机。大多客户用此方法来抽提2-4mL血浆,得到的游离核酸用于后续的PCR、NGS、甲基化研究。整个抽提过程需要约45min-3h不等,具体的操作时间要根据使用的品牌来定。

NucleoSnap® DNA Plasma 仅需要45min 即可完成EDTA处理的血浆游离核酸的抽提,是目前提取速度较快的游离核酸提取试剂盒。提取到的游离核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等检测手段。

应用数据:

从5mL EDTA血浆中纯化cfDNA
NucleoSnap® DNA Plasma kit 和竞争对手(Competitor Q)比较结果

从Cell-Free DNA BCT® (Streck)提取cfDNA
 3个不同Cell-free DNA BCT® 保存的样品,分别使用 NucleoSnap® DNA Plasma (MN) 和a vacuum-processed kit of a competitor (Q)提取cfDNA.使用Bioanalyzer™ 2100 with a High Sensitivity DNA Kit (Agilent)检测,分离到的游离核酸在170bp附近有典型的峰(箭头标记)

10mL尿液中分离cfDNA电泳图
抽提的cfDNA使用 Bioanalyzer™ 2100 with a High Sensitivity DNA Kit (Agilent)分析,在170bp附近有典型的片段分布

单管离心

单管离心抽提游离核酸的方法一般适用于小体积血清或者血浆样本,通常样本体积范围在200uL-2mL。由于样本上样量少,游离核酸的得率也较多管真空抽滤的方式要低。此类方法得到的游离核酸一般用来进行PCR、qPCR等分子检测。

PCR需要的模板量一般是很低的。常规的20-30uL洗脱体积,一般只用到10%。有没有一种方法可以让洗脱体积更小,单位体积里面浓缩更丰富的核酸?

NucleoSpin® Plasma XS应运而生,采用独特的设计,柱膜直径是普通柱膜的一半,仅需要240uL 血浆,5-20uL洗脱液,就可以得到的高浓度核酸,后续的QPCR检测灵敏度也更高。

洗脱体积的大小决定于柱膜直径!

MN NucleoSpin® Plasma XS:柱膜面积最小,仅5–20 μL洗脱体积就可以得到有效的游离核酸.
Competitor Q (Q):尽管此试剂盒适用于小样本量,但是没有针对此应用做专门的设计,洗脱体积至少 20–30 μL.

 
NucleoSpin® Plasma XS非常适合孕妇血浆中游离核酸检测。

应用数据:

PCR检测cfDNA中的RHD和Amelogenin基因NucleoSpin®Plasma XS和MagNA Pure Compact Nucleic Isolation Kit I – Large Volume相比,相同的上样量 NucleoSpin®表现出更好的性能,分别提前2.6 cycles (RHD gene) 和 2.1 cycles (Amelogenin) 捕获到PCR信号。
Data kindly provided by Dr. Doescher, DRK Blutspendedienst NSTOB, Oldenburg, Germany

PCR检测cfDNA中k-ras基因NucleoSpin® Plasma XS 和QIAamp DNA Blood Midi相比,NucleoSpin® Plasma XS在低于2.7倍PCR上样量的同时,提前2.1cycles捕获到PCR信息。
Data kindly provided by Dolores C. García-Olmo, PhD, Unidad de Investigación, Complejo Hospitalario Universitario de Albacete, Albacete, Spain

谈论到单管离心的方式提取游离核酸,还要给大家介绍一款产品Covaris truXTRAC™ cfDNA。

Covaris truXTRAC® cfDNA提取试剂盒配合Covaris自动聚焦超声技术(Adaptive Focused Acoustics,AFA) ,主动解交联提取cfDNA,相比传统方法,cfDNA提取的得率、质量和复杂度都得到显著提高,更少的血液量即可满足下游检测分析需求。同时除提取单核小体凋亡cfDNA外,还可获取血液中少量存在的核小体二聚体、三聚体cfDNA和非凋亡长片段cfDNA,帮助后续研究获取更多疾病相关信息!

truXTRAC® 获取的cfDNA种类更丰富:

不同cfDNA提取方法获得cfDNA片段分析
用truXTRAC cfDNA和传统柱提取法Q试剂盒从相同临床血液样本中提取的cfDNA通过Fragment Analyzer(AATI)分析。结果显示truXTRAC cfDNA试剂盒配合AFA技术,无基因组DNA污染,除提取到单核小体凋亡cfDNA外,还获得了血液中少量存在的核小体二聚体、三聚体cfDNA片段和非凋亡长片段cfDNA,帮助后续研究获得更多信息,如检测癌症患者是否存在耐药性突变等。

truXTRAC® 显著提高cfDNA得率:

不同cfDNA提取方法得率比较
用truXTRAC cfDNA和传统柱提取法Q试剂盒从相同10个临床血液样本提取cfDNA。cfDNA得率使用Qbit检测,柱状图表示得率范围,X表示10个供体cfDNA得率的平均值。结果显示Covaris truXTRAC cfDNA试剂盒配合AFA技术,显著提高cfDNA得率。

96孔板真空抽滤

采用柱膜法原理抽提游离核酸,一次可以抽提96个样本,极大的方便了样本量较多的客户。

此类产品一般只适用2mL血浆、血清等样品,提取到的游离核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等检测手段。
此类提取方法的代表试剂盒就是NucleoSpin® 96 DNA Plasma。此试剂盒可以在真空抽滤自动化核酸抽提平台使用,比如:Eppendorf。


NucleoVac 96 Vacuum Manifold

也可以在真空抽滤装置NucleoVac 96 Vacuum Manifold上使用,此类方法可以极大地节省购买仪器的费用。

应用数据:

采用96孔板抽滤的方式,从2mL血浆中抽提cfDNA的得率结果
无论是不同个体还是不同的采血管均能得到较好的游离核酸抽提结果

磁珠法高通量

磁珠法是最容易实现自动化通量抽提的一种核酸抽提方式,可处理1-10mL血浆样品,形式也更灵活。提取到的游离核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等检测手段。

磁珠法得率的高低主要取决于试剂盒中磁珠的类型。NucleoMag® DNA Plasma采用MN 磁珠- 超顺磁性。“超顺磁性”代表磁珠可以被磁场吸附,但是自身不会被磁化,不会聚集在一起,很容易在溶液中被悬浮;磁珠直径 1–3 µm,能够保证沉降时间,更有利于HTP处理方式,此外小珠有更大的聚集表面积,这也是磁珠拥有最大结合能力所必须的。

从不同体积的血浆中分离cfDNA
通过Bioanalyzer™ 2100 系统和PicoGreen™ quantification assay检测5组血浆中提取的游离核酸结果显示,The NucleoMag® DNA Plasma kit 可以从2-10mL血浆中高效的提取。

关键词:远慕生物  生物试剂  细胞  

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